周恩来祖居位于绍兴市区劳动路369号(保佑桥河沿)。祖居系明清风格的台门式建筑，乌墙青瓦，素雅端庄，占地面积2150平方米，建筑面积1680平方米。周氏于明代自河南迁徙绍兴后即世居于此。清康熙二十八年(1689)，周恩来远祖周懋章之妻王氏寿至百岁时，浙江巡抚特题“百岁寿母”匾额志贺，故又称“百岁堂”。整体建筑坐北朝南，分三条轴线布局。
中轴第一进为门斗，三开间，黑漆竹丝台门，门楣上悬陈云书“周恩来祖居”匾，内设隐门，上悬顾廷龙书“百岁寿母之门”匾，仪门砖檐戏壁。
第二进为大厅，三开间，中额悬“锡养堂”匾，高大宽畅，前后各有花格子木窗，原为周氏家族举办红白事之地，现辟为瞻仰厅。厅正中竖立周恩来1939年春到绍兴时身着戎装的汉白玉站立雕像，两侧悬挂马一浮撰、赵朴初书“选贤与能讲信修睦，体国经野辅纪长民”楹联，两侧山墙内壁各嵌制一幅周恩来在不同历史时期的巨幅照片。
第三进为座楼，三开间，中间为客厅，内陈设六角拼桌和古式书桌等物。当年周恩来曾在此与亲友共餐、接待各界人士、为亲友挥毫题词。他的题词依不同对象内容各异而主题相同，其中为工人题词“为光明而奋斗”;为爱国人士题词“埋头苦干，只要抗战胜利，必定苦尽甜来”;为青年题词“冲过钱塘江，收复杭嘉湖”;为长辈题词“生聚教训，廿年犹未为晩”;为学生题词“青年是黄金时代，要学习学习再学习”;为妇女题词“勿忘鉴湖女侠之遗风，望为我越东儿女争光”等。周恩来思虑缜密、处事稳妥之风格，由此可见一斑。其间，周恩来还提笔续写了周氏宗谱：“恩来，字翔宇，五十房樵水公曾孙、云门公长孙，懋臣长子，出继簮臣为子。生于光绪戊戌年二月十三日卯时。妻邓颖超。”
中明堂西厢房是周恩来当年下榻处，面积不足10平方米，陈设极为简朴，仅一床、一桌、一椅而已。
东轴第一进平屋、第二进厢楼，均为三间，屋、楼间设东厢互联。现悉数辟为展览室，陈列《周恩来与故乡》展览，用大量历史照片、手稿题词和创作油画等展品，展现周恩来当年回故乡时的情景，以及风尘仆仆赴皖浙视察抗日前线的概况。西轴进入石库门斗后为一方天进，第二进“诵芬堂”，其开间结构比拟“锡养堂”，现作厅堂原状陈列。第二进各间布置为周氏祖上客厅、书房、卧室等生活场景。
